LAPORAN MIKROBIOLOGI

BAB I
PENDAHULUAN
Dalam praktikum kali ini kita melakukan berbagai macam kegiatan. Diantaranya adalah sterilisasi, medium dan larutan pengencer, metode hitungan cawan, pewarnaan bakteri. Sterilisasi merupakan suatu usaha membebaskan alat-alat atau bahan-bahan dari segala macam bentuk kehidupan, termasuk mikroba. Mikroba dapat tumbuh dan berkembang dengan baik didalam medium dan larutan pengencer yang merupakan suatu bahan yang terdiri atas campuran nutrisi yang dipakai untuk menumbuhkan mikroba. Kemudian untuk menghitung jumlah bakteri dari medium tersebut menggunakan metode hitungan cawan yang merupakan metode perhitungan jumlah mikroba dalam bahan pangan. Cara mempermudah perhitungan mikroba salah satunya yaitu dengan pewarnaan bakteri yang merupakan suatu cara untuk pewarnaan bakteri yang terkandung dalam bahan pangan dengan larutan NA, gram A (violet kristal), gram B (lugol), gram C (etanol), dan gram D (safranin).
Tujuan dari praktikum mikrobiologi diantaranya strerilisasi bertujuan untuk membebaskan alat-alat atau bahan-bahan dari segala macam kehidupan, termasuk mikroba, medium dan larutan pengenceran bertujuan untuk mengisolasi, memperbanyak, penguji sifat-sifat fisiologis dan sebagai media penghitungan jumlah mikroba, metode hitungan cawan bertujuan untuk menghitung jumlah mikroba dalam bahan pangan, dan pewarnaan bakteri bertujuan untuk mewarnai bakteri yang merupakan modifikasi dari cara pewarnaan sederhana. Manfaat praktikum Mikrobiologi umum ini adalah agar dapat mengetahui pertumbuhan dan perkembangan mikroba dalam makanan dimana mikroba mempunyai banyak hubungan dan peranan yang sangat penting dalam kehidupan makhluk hidup.














BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Sterilisasi
Sterilisasi adalah usaha pembebasan suatu bahan dari mikroorganisme hidup atau stadium istirahatnya. Metode sterilisasi terbagi atas tiga klasifikan utama, yaitu sterilisasi secara fisik, secara kimia dan secara mekanis atau filtrasi (Robinson, 1990). Contoh dari sterilisasi secara fisik antara lain pemanasan lembab, sterilisasi kering, dan penyinaran. Perlakuan pada sterilisasi secara kimia merupakan analogi penggunaan senyawa kimia baik etileneoksida (oxiran), β-propiolakton maupun dietilkarbonat. Sedangkan sterilisasi secara mekanis dilakukan dengan silinder porselin yaitu lilin chamberland dan filter berkefeld (Schlegel dan Schmidt, 1994). Kecepatan pematian atau pemusnahan yang eksponensial tidak hanya tergantung dari jenis mikroorganisme saja tetapi dari berbagai kondisi lingkungan. Sebagai ganti kecepatan ini, sebagai kriteria terjadi peristiwa pematian pada kondisi tertentu dan populasi tertentu digunakan nilai D, yaitu waktu yang diperlukan untuk pematian 90% dari sel, juga disebut masa reduksi desimal (Schlegel dan Schmidt, 1994).

2.1.1. Sterilisasi kering
Sterilisasi kering merupakan proses pemusnahan bakteri yang terdapat pada peralatan praktikum dengan menggunakan oven. Hal ini bermanfaat dalam penelitian mikroorganisme yang membutuhkan peralatan steril agar peralatan tersebut tidak terkontaminasi oleh mikroorganisme yang tidak diinginkan, sterilisasi harus dapat membunuh jasad renik yang paling tahan panas yaitu spora bakteri (Fardiaz, 1992). Apabila masih terdapat pertumbuhan mikroorganisme hal ini menunjukkan pertumbuhan bakteri masih berlangsung dan proses sterilisasi yang tidak sempurna (Lay, 1994).
Alat sterilisasi kering yang biasa digunakan adalah oven. Cara sterilisasi peralatan menggunakan autoklaf yaitu botol bersih diberi beberapa tetes aquades dan tutup dengan alumunium foil, jangan ditutup terlalu rapat karena saat pemanasan berlangsung dapat timbul pemuaian. Alat dan kertas saring dibungkus dengan kertas tebal atau diletakkan pada baki stainless steel kemudian bungkus baki dengan kain tebal sebelum dimasukkan ke dalam oven. Peralatan sektio seperti pinset, gunting gagang skalpel dan jarum dibungkus dengan kertas kopi atau kertas merang. Alumunium foil tidak dianjurkan sebagai pembungkus karena uap air tidak dapat menembusnya. Temperatur yang digunakan untuk sterilisasi botol kultur kosong dan peralatan yang akan digunakan untuk menanam eksplan adalah 170° C pada tekanan 1 atm selama 60 menit, perhitungan waktu dimulai setelah suhu dan tekanan mencapai tingkat yang diinginkan. Sedangkan cara sterilisasi dengan oven adalah botol, tabung reaksi dan erlenmeyer dicuci bersih dan masukan ke dalam oven selama 1 jam pada temperatur 170° C dengan sistem udara statis. Keuntungan dari sterilisasi kering yaitu tidak ada uap air yang membasahi peralatan yang disterilkan (Fardiaz, 1992). Selain itu juga menghemat waktu dan alat-alat yang dibutuhkan (Dwijoseputro, 2003).

2.1.2. Sterilisasi Basah
Sterilisasi basah adalah proses pemusnahan bakteri yang terdapat pada peralatan praktikum yang akan digunakan dengan menggunakan autoklaf. Biasanya menggunakan autoklaf dengan temperatur 121° C dan tekanan seitar 2 atm. Lamanya sterilisasi tergantung pada volum dan jenis bahan yang disterilkan. Air biasanya disterilkan selama 1 jam dan media selama 20 – 40 menit. Sterilisasi yang terlalu lama dapat mengakibatkan penguraian gula, degradasi vitamin dan asam amino, inaktivasi sitokinin zeatin riboside, dan perubahan pH yang mengakibatkan depolimerisasi agar. Proses sterilisasi aquades menggunakan autoklaf listrik lebih efektif jika digunakan wadah dengan volum 200 – 500 ml yang diisi 80% volum, tutup dengan keras dan kencangkan dengan karet gelang. Waktu sterilisasi selama 30 menit pada tekanan 1 atm. Apabila waktu sterilisasi aquades dan media telah selesai, autoklaf tidak boleh diturunkan tekanannya secara mendadak, karena apabila diturunkan mendadak cairan didalamnya akan mendidih dan bubbled up atau meluap (Fardiaz, 1992). Selain itu juga akan berdampak pada meluapnya cairan yang terdapat didalm tabung reaksi dan erlenmeyer (Cappucino, 1983).

2.2. Medium Nutrient Agar (NA)
NA adalah suatu larutan biak yang dapat dibuat dari senyawa NB (Nutrient Broth) yang didalamnya mengandung ekstrak daging dan pepto ditambah 1,5 % agar dipakai untuk menumbuhkan mikroorganisme (Schlegel dan Schmidt, 1994). NA merupakan salah satu teknik yang sangat baik untuk memisahkan mikroba karena NA itu bernuansa basa sehingga dapat diketahui masing-masing morfologinya (Harsono, 2001).

2.3. Medium Potato Dextrose Agar (PDA)
Medium harus mengandung semua nutrisi yang mudah digunakan oleh mikroorganisme. PDA dibuat untuk menumbuhkan jamur. Hal itu dikarenakan jamur membutuhkan medium yang mengandung karbohidrat, dan pada medium PDA ini terdapat kentang (sumber karbohidrat) sebagai media yang cocok untuk menumbuhkan jamur. PDA (Potato Dextrose Agar) yaitu digunakan untuk kultivasi dan identifikasi jamur sehingga mempermudah dalam morfologinya (Fardiaz, 1994). PDA terbuat dari kentang dengan campuran dextrose dengan menggunakan perbandingan yang benar. Didalam ilmu biologi disebutkan bahwa bakteri hidup di suasana asam, hal ini menunjukkan bahwa PDA cocok untuk mengembangbiakkan mikroba (Penn, 1991).

2.4. Morfologi Jamur
Jamur (fungi) merupakan suatu kelompok organisme yang mempunyai inti, tidak berklorofil, mempunyai spora, umumnya berkembang biak secara seksual dan atau aseksual, umumnya berbentuk filamen, struktur somatilnya bercabang-cabang, dinding selnya terdiri dari sellulosa, kitin atau kombinasi dari antara keduanya (Lay, 1994). Jamur dibagi menjadi 3 yaitu Kapang (jamur benang), Khamir (yeast), cendawan (Mushroom) (Finegold, 2000). Kapang merupakan jamur benang yang membentuk filamen panjang yang disebut hifa dan merupakan ciri utama fungi. Hifa mempunyai 2 struktur yaitu bersepta dan tidak bersepta. Septa ini menyekat sel sehingga filamen yang panjang ini terlihat sebagai rantai sel. Hifa yang tidak bersepta disebut hifa kenosistik. Hifa kenosistik mempunyai ciri oomycetes dan zygomycetes, sepanjang hifa bersepta lazim ditemukan pada asomycetes, basisiomycetes dan deoteromycetes. Beberapa contoh kapang adalah Rhizopus sp, Aspergillus, Penicillium (Dwidjoseputro, 1993).
Khamir merupakan fungi yang tidak berfilamen dan bereproduksi melewati pertunasan atau pembelahan sel. Bentuk koloni sering kali mirip dengan bakteri. Khamir digunakan dalam pembutan roti dan anggur, namun ada pula khamir yang dapat menimbulkan penyakit. Contoh : Khamir Patogen adalah Kandida dan Cryptococcus. Beberapa jenis atau spesies dapat membentuk misellium semu (pseudomiselium) (Dwidjoseputro, 1993). Cendawan Merupakan kelompok fungi yang mempunyai tubuh buah besar (makroskopik), sedangkan miselliumnya mikroskopik. Berkembang biak dengan cara seksual melalui pembentukan basidiospora. Contoh cendawan : Agaric sp, Auricula sp, volvoriela sp (Schlegel dan Schmidt, 1994).

2.5. Morfologi Bakteri
Mayoritas bakteri memiliki bentuk kokus, basil, dan rantai panjang. Kokus berbentuk seperti buah beri jika diamati dengan mikroskop. Biasanya berkembangbiak dengan membelah diri kemudian saling melekat dengan bakteri lainnya, contohnya Streptococcus thermiphilis pada yoghurt dicirikan dengan sel yang membelah menjadi dua kokus, pada pembelahan berikutnya kokus memisahkan diri, biasanya dengan meninggalkan dua kokus yang melekat satu sama lain (Magamii, 2009). Basil merupakan bentuk bakteri yang menyerupai batang atau silinder. Basil-basil sangat beraneka ragam dalam ukuran. Beberapa diantaranya menyerupai rokok sigaret. Basil-basil ini sangat menyerupai kokus sehingga disebut koo-basil. Basil membelah dalam satu bidang, oleh sebab itu seringkali terlihat sebagai sel tunggal, berpasangan atau dalam rantai pendek maupun panjang, sedangkan pada bakteri berbentuk kokus panjang rantai bukan merupakan tanda pengenal (Gaman & Sherrington, 1992).

2.6. Metode Hitung Cawan
2.6.1. Pengenceran
Pengenceran bertujuan untuk mengurangi konsentrasi atau kekentalan dari suatu bahan agar setelah masa inkubasi koloni mikroba yang tumbuh jumlahnya dapat dihitung dengan mudah. Jumlah koloni yang muncul setelah masa inkubasi paling baik yaitu antara 30-300 koloni. Perbandingan dalam melakukan pengenceran biasanya dalam bentuk desimal, misalnya 1:10 , 1:100, 1:1000 dan seterusnya. Larutan yang digunakan untuk melakukan pengenceran biasanya buffer fosfat, larutan garam fisiologis 0,85%, larutan ringer juga aquades (Dwidjoseputro, 1993). Pengenceran pada sampel dapat dilakukan beberapa kali agar biakan yang didapatkan tidak terlalu padat atau memenuhi cawan (biakan terlalu padat akan mengganggu pengamatan). Sekitar 1 ml suspensi dituang ke dalam cawan petri steril, dilanjutkan dengan menuangkan media penyubur (Acidified Potato Dextrose Agar) steril hangat dengan suhu antara 40 – 50°C, kemudian ditutup rapat dan diletakkan dalam inkubator bersuhu 37°C selama 1 – 2 hari dengan posisi dibalik (Megamii, 2009).

2.6.2. Metode Tuang
Metode cawan tuang sangat mudah dilakukan karena tidak membutuhkan keterampilan khusus dengan hasil biakan yang cukup baik. Metode ini dilakukan dengan mengencerkan sumber isolat yang telah diketahui beratnya ke dalam 9 ml garam fisiologis (NaCl 0.85%) atau larutan buffer fosfat. Larutan ini berperan sebagai penyangga pH agar sel bakteri tidak rusak akibat menurunnya pH lingkungan. Penuangan dilakukan secara aseptik atau dalam kondisi steril agar tidak terjadi kontaminasi atau masuknya organisme yang tidak diinginkan seperti tumbuhnya kapang dalam biakan). Media yang dituang hendaknya tidak terlalu panas, karena selain mengganggu proses penuangan, media panas juga masih mengeluarkan uap yang akan menempel pada cawan penutup, sehingga mengganggu proses pengamatan. pada metode ini, koloni akan tumbuh di dalam media agar. Kultur diletakkan terbalik, dimasukkan di dalam plastik dengan diikat kuat kemudian diletakkan dalam inkubator selama 48 jam (Megamii, 2009).

2.6.3. Menghitung Jumlah Bakteri
Salah satu cara penghitungan bakteri adalah dengan menggunakan metode hitung cawan atau Standard Plate Count (SPC). Prinsip kerjanya adalah jumlah masing-masing cawan diamati setelah inkubasi, cawan yang dipilih untuk penghitungan koloni ialah yang mengandung antara 30 sampai 300 koloni, karena jumlah mikroorganisme dalam sampel tidak diketahui sebelumnya, maka untuk memperoleh sekurang-kurangnya satu cawan yang mengandung koloni dalam jumlah yang memenuhi syarat tersebut maka harus dilakukan sederetan pengenceran dan pencawanan. Jumlah organisme yang terdapat dalam sampel asal ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni yang terbentuk dengan faktor pengenceran pada cawan yang bersangkutan (Penn, 1991).

2.7. Pewarnaan gram
Pewarnaan Gram adalah suatu cara kerja pewarnaan yang paling berguna yang dilakukan dalam bakteriologi. Metode pewarnaan gram dapat menghasilkan dua kemungkinan yakni pewarna gram negatif menghasilkan warna merah dan gram positif menghasilkan warna ungu-biru. Ada pula bakteri pada usia tertentu berubah dari gram positif menjadi gram negatif atau sebaliknya. Pewarnaan bakteri diambil dari suatu piaraan yang masih muda, kira-kira umur 24 jam karena baik untuk memperlihatkan bentuk morfologinya. Pewarnaan bakteri dengan cara pewarnaan gram memiliki 4 tahapan pewarnaan yaitu pemberian larutan gram A yaitu kristal violet sebagai pewarnaan dasar, lalu larutan gram B yaitu iodium sebagai cat penguat, larutan gram C yaitu ethyl alkohol 95 % sebagai peluntur cat dan larutan gram D yang berisi larutan safranin (Dwidjoseputro, 2005). Metode pewarnaan gram dapat menghasilkan dua kemungkinan yakni pewarnaan gram negatif yang menghasilkan warna merah dan gram positif yang menghasilkan warna ungu-biru. Ada pula bakteri pada usia tertentu berubah dari gram positif menjadi gram negatif atau sebaliknya (Dwidjosaputro, 2003).
Ada pula bakteri yang bersifat gram variabel. Bakteri-bakteri ini mempunyai sifat intermedier antara gram positif dan gram negatif. Mikroorganisme gram positif merupakan mikroorganisme yang berwarna violet dimana warna tersebut tidak akan hilang jika disiram alkohol atau aseton, karena sel-sel bakteri tersebut mengikat zat warna dasar (utama) dengan kuat, sehingga tidak dapat dilunturkan oleh zat peluntur dan tidak terwarnai oleh zat lawan, sedangkan mikroorganisme negatif adalah mikroorganisme yang akan hilang warna violetnya jika disiram dengan alkohol atau aseton dan kemudian akan berwarna merah muda dengan karbol fuchsin atau merah netral. Faktor-faktor yang dapat menyebabkan variasi dalam pewarnaan gram antara lain perubahan keasaman, penyimpangan cara pewarnaan, komposisi medium, umur bakteri, perlakuan khusus. Perbedaan hasil dari pewarnaan ini disebabkan karena adanya variasi didalam lapisan permukaan dari kedua jenis mikroba itu (Michael, 1988).














BAB III
MATERI DAN METODE
Praktikum Mikrobiologi Umum dilaksanakan pada hari Minggu, tanggal 11 April 2010 pukul 08.00-12.00 dan hari Senin, tanggal 12 April 2010 pukul 12.00-14.00 di Laboratorium Fisiologi dan Biokimia Fakultas Peternakan Universitas Diponegoro Semarang.

3.1. Materi
Peralatan yang digunakan adalah oven sebagai tempat sterilisasi kering peralatan praktikum yang terbuat dari gelas, autoklaf sebagai tempat sterilisasi basah bahan-bahan praktikum yang berupa larutan, pipet hisap sebagai alat yang disterilisasi dan berfungsi untuk mengambil sampel larutan, cawan petri sebagai alat yang disterilisasi kering dan berfungsi sebagai tempat penanaman bakteri, pisau untuk mengupas dan memotong kentang, timbangan untuk menimbang berat bahan praktikum, kompor listrik untuk mendidihkan kentang, beker glass sebagai tempat larutan, gelas ukur untuk mengukur volume larutan, kertas saring untuk menyaring filtrat larutan, tabung reaksi sebagai tempat untuk sterilisasi basah, bunsen untuk pemanasan, loop untuk mengambil sampel bakteri, kaca objek sebagai tempat sampel bekteri yang akan diamati serta mikroskop sebagai alat untuk mengamati sampel bakteri.
Bahan yang digunakan adalah kertas pembungkus untuk membungkus peralatan yang disterilisasi, kapas untuk menutup bagian mulut tabung reaksi dan bagian pangkal pipet hisap, alkohol 70 % untuk membersihkan peralatan sebelum dibungkus. NB 0,65 gram, kentang, agar, aquades, kefir sebagai bahan untuk pembuatan medium. Larutan gram A yaitu kristal violet sebagai pewarnaan dasar, lalu larutan gram B yaitu iodium sebagai cat penguat, larutan gram C yaitu ethyl alkohol 95 % sebagai peluntur cat dan larutan gram D yang berisi larutan safranin, larutan tersebut sebagai bahan untuk pewarnaan bakteri. Kefir sebagai sampel bakteri, serta sampel bakteri yang digunakan dalam pewarnaan gram yaitu Staphylococcus aureus dan Lacthobacillus bulgaricus.

3.2. Metode
3.2.1. Sterilisasi Kering
Menyiapkan pipet, cawan petri, lalu membersihkan cawan petri dengan menggunakan kapas yang dibasahi alkohol untuk menghilangkan kotoran dan lemak yang menempel pada cawan, kemudian bungkus cawan petri dengan kertas pembungkus. Lalu bersihkan pipet hisap dan sumbat bagian pangkal pipet dengan kapas, kemudian bungkus pipet dengan kertas, jangan lupa beri tanda pada bagian ujung dan pangkal. Memasukkan cawan petri ke dalam oven selama 1 jam pada suhu 170C. Mengeluarkan cawan petri, kemudian menunggu pipet hisap hingga dingin (suhu ruangan) sebelum dipakai.

3.2.2. Sterilisasi Basah
Memasukkan medium yang akan disterilisasi ke dalam tabung reaksi, kemudian tutup rapat dengan kapas. Memasukkan tabung reaksi tersebut ke dalam autoklaf lalu metutup autoklaf dengan rapat. Menyalakan autoklaf, menunggu hingga manometer dan termometer menunjukkan tanda sterilisasi pada suhu 121C dan 2 atm, lalu mendiamkan selama 15 menit. Setelah selesai, membuka katup pengaman dan biarkan hingga autoklaf tidak lagi bertekanan. Setelah itu, membuka autoklaf dan mengeluarkan mediumnya. Khusus untuk medium agar, untuk menurunkan suhunya dan menjaga agar tidak membeku maka memasukkan medium ke dalam inkubator bersuhu 55C, sebelum digunakan.

3.2.3. Medium Nutrient Agar (NA)
Menimbang NB sebanyak 0,65 gram, melarutkan ke dalam 50 ml aquades, kemudian mengaduk medium NA dengan pengaduk magnetik hingga larutan menjadi homogen. Memasukkan medium NA agar pada autoklaf dengan suhu 121C dan tekanan 2 atm , kemudian mengeluarkan dan medinginkan selama 15 menit.

3.2.4. Medium Potato Dextrose Agar (PDA)
Kupas kentang dan iris dengan ukuran 1x1x1 cm3, menimbang kentang dengan tepat sebanyak 250 gram. Memasukkan kentang ke dalam bekerglass, lalu tambahkan 500 ml aquades, menutup bekerglass dengan alumunium foil serapat mungkin. Memanaskan dalam waterbath hingga mendidih selama 30 menit, mengambil filtrat setelah dingin kemudian lumat kentang hingga hancur. Mengambil fitrat kentang sebanyak 200 ml dengan cara menyaringnya menggunakan kain saring yang bersih. Setelah fitrat terkumpul mengukur volumenya untuk membuat medium PDA dengan komposisi 50 ml filtrat kentang, 1 gram dextrose dan 1 gram agar, kemudian mensterilisasi di autoklaf dan mengeluarkan serta medinginkan selama 15 menit.

3.2.5. Metode Hitung Cawan
Metode hitung cawan adalah metode yang digunakan untuk menghitung jumlah mikroba dalam bahan pangan. Metode yang digunakan dalam Hitungan Cawan terbagi atas beberapa tahapan seperti Pengenceran, Metode Tuang, dan Cara Menghitung Koloni.

3.2.5.1. Pengenceran. Menyiapkan larutan pengencer yaitu aquades yang telah disterilkan, serta membersihkan meja kerja dengan alkohol agar steril. Melakukan pengenceran sampai tingkat pengenceran yang ditentukan yaitu 10-7 yang dilakukan di dekat bunsen untuk menghindari kontaminasi dari mikroba lain yang keberadaannya tidak diinginkan. Cara pengenceran yang dilakukan dengan menghisap 1 ml sampel cair (larutan kefir) menggunakan pipet hisap 1, kemudian memasukkannya ke dalam tabung reaksi 1 yang berisi larutan pengencer. Mengambil 1 ml larutan dari tabung reaksi 1 menggunakan pipet hisap 2 kemudian memasukkannya ke dalam tabung reaksi 2, mengambil 1 ml larutan pada tabung reaksi 1 kemudian memasukkannya ke dalam cawan petri 1 (pengenceran 10-1). Skema ini berulang sampai pengenceran 10-7.

3.2.5.2. Metode Tuang. Metode tuang dilaksanakan setelah pengenceran dimana sampel mikroba yang telah dimasukkan dalam cawan petri sebanyak 1 ml, kemudian menambahkan medium agar ke dalam cawan petri 10-15ml dan menggoyangkannya membentuk angka delapan hingga merata memenuhi seluruh permukaan. Saat penuangan medium agar berlangsung, cawan tidak boleh dibuka terlalu lebar dan melakukannya di dekat api busen agar menghindari kontaminasi bakteri lain. Setelah sampel membeku, posisi cawan petri dibalik dan memasukkannya ke dalam inkubator pada suhu ruang selama 24 jam.

3.2.5.3. Cara Menghitung Koloni. Metode penghitungan koloni pada cawan adalah cawan yang dipilh dan dihitung hanya yang mengandung jumlah koloni antara 30 – 300, beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan suatu kumpulan koloni besar dimana jumlah koloni sebenarnya diragukan maka dihitung satu koloni, dan suatu deretan koloni yang terlihat sebgai suatu garis tebal dihitung sebagai satu koloni. Menghitung koloni dengan menggunakan loop,kemudian diberi tanda dengan menggunakan spidol hitam untuk penghitungan biar tidak terjadi penghitungan ganda.

3.2.6. Pewarnaan Gram

Metode yang digunakan adalah membersihkan kaca objek dengan alkohol. Membakar ujung loop hingga panas kemudian di dinginkan. Melakukan fiksasi dengan memanaskannya di atas bunsen. Setelah kering, meneteskan violet kristal (gram A) menggunakan pipet di atas sampel bakteri pada kaca objek, mendiamkannya selama 2 menit kemudian membilasnya dengan aquades. Membuang sisa aquades yang tersisa dan menetesi kaca objek dengan lugol (gram B) selama 1 menit, kemudian membilasnya dengan aquades. Menghilangkan warna pada kaca objek dengan etanol (gram C) hingga warna biru tidak luntur lagi kemudian membilasnya dengan aquades. Meneteskan safranin (gram D) selama 30 detik, membilasnya dengan aquades kemudian membersihkan sisa air dengan tisu. Meletakkan cairan minyak imersi di atas kaca objek tersebut. Melihat bentuk bakteri dengan menggunakan mikroskop.

















BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Medium Nutrient Agar (NA)
Medium yang digunakan untuk melakukan inokulasi bakteri pada praktikum adalah medium NA yang dibuat dengan komposisi aquades 50 ml dan 0,75 agar, 0,65 NB. NB yang digunakan dalam praktikum sudah dalam bentuk bahan jadi. NB tersebut biasanya tersusun atas rebusan ekstrak daging 3 gram ditambah pepto dan agar 3 gram. NA sangat cocok untuk sebagai medium pertumbuhan bakteri. Penggunaan bahan tersebut untuk memenuhi nutrisi yang dibutuhkan bakteri untuk berkembang biak. Menurut Lay (1994), dasar makanan yang paling baik bagi pemeliharaan dan pembiakan bakteri adalah medium yang mengandung zat-zat organik seperti rebusan daging, sayur-sayuran, sisa makanan atau ramuan-ramuan yang dibuat oleh manusia.

4.2. Medium Potato Dextrose Agar (PDA)
Potato Dextrose Agar (PDA) yang dihasilkan dalam praktikum mikrobiologi ini berbentuk padat sehingga mikroorganisme dapat tumbuh dan berkembang, hal ini sesuai dengan pendapat Dwidjoseputro (2003) yang menyatakan bahwa pembuatan medium yang dilakukan oleh manusia dapat berupa medium cair dan medium padat, dulu orang menggunakan kentang yang dipotong-potong untuk medium setelah medium itu disterilisasikan kemudian dibiarkan mendingin maka kita peroleh medium padat yang dapat ditanami mikroorganisme. Dalam pembuatan PDA dengan komposisi 50 ml filtrat kentang, 1 gram dextrose dan 1 gram agar. Penggunaan dextrose pada medium ini karena bakteri akan tumbuh pada medium yang mengandung karbohidrat sebagai nutrisi yang mudah dicerna energi pertumbuhannya. Hal ini sesuai dengan pendapat Fardiaz (1994) yang menyatakan bahwa mikroorganisme dapat tumbuh dan berkembang dengan baik didalam medium, maka medium harus mengandung semua nutrisi yang mudah digunakan oleh mikroorganisme.

4.2. Metode Hitungan Cawan
Berdasarkan hasil percobaan yang telah dilaksanakan diperoleh hasil sebagai berikut:
Tabel 1. Hasil Pada Metode Hitungan Cawan
Sampel Pengenceran SPC
10-5 10-6 10-7 CFU/ml
PDA
392
316 228 2,3 x 109
NA 304 173 107 1,7 x 108
Sumber: Data Primer Praktikum Mikrobiologi Umum, 2010.

Berdasarkan tabel di atas dapat diketahui bahwa proses penanaman bakteri yang dilakukan dengan pengenceran sampai tingkat 10-7 mampu menumbuhkan bakteri pada tiap-tiap cawan petri baik yang menggunakan sampel padat larutan kentang atau Potato Dextrose Agar (PDA) maupun yang menggunakan sampel cair (kefir). Jumlah bakteri dari sampel yang diperoleh sebagaimana yang tertera dalam tabel di atas, jika dihitung menurut Standar Plate Count (SPC) dapat diketahui jumlah bakteri yang terhitung adalah 2,3 x 109 CFU/ml untuk sampel larutan PDA dan 1,7 x 108 CFU/ml bakteri pada sampel larutan NA. Penghitungan ini sesuai dengan pernyataan Penn (1991) yang menyatakan bahwa cara penghitungan bakteri dapat dilakukan mengamati cawan setelah proses inkubasi selesai, cawan yang dipilih untuk penghitungan koloni ialah yang mengandung antara 30 sampai 300 koloni, karena jumlah mikroorganisme dalam sampel tidak diketahui sebelumnya, maka untuk memperoleh sekurang-kurangnya satu cawan yang mengandung koloni dalam jumlah yang memenuhi syarat tersebut maka harus dilakukan sederetan pengenceran dan pencawanan. Jumlah organisme yang terdapat dalam sampel asal ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni yang terbentuk dengan faktor pengenceran pada cawan yang bersangkutan

4.3. Pewarnaan Gram
Berdasarkan praktikum pewarnaan gram didapatkan hasil pada gambar di bawah ini:
Nama Bakteri Lactobacillu bulgariscus
Hasil Pengamatan Dalam Mikroskop


Warna Biru Keunguan
Bentuk Bulat Batang
Koloni Monobacilus
Gram Positif
Sumber: Data Primer Praktikum Mikrobiologi Umum, 2010
Ilustrasi 1. Pewarnaan Gram
Berdasarkan gambar diatas pewarnaan gram pada Lactobacillus bulgaricus tampak warna dasar ungu dengan bentuk basillus atau batang. Hal ini sesuai dengan pendapat Pelczar (1988) yang menyatakan sel Lactobacillus bulgaricus berbentuk basillus atau batang dengan ukuran 0,3 – 2,2 μm x 1,27 – 7,0 μm, bakteri ini termasuk bakteri yang mempunyai gram positif. Menurut pendapat Lay (1994) yang menyatakan bahwa pengamatan pewarnaan gram untuk bakteri Lactobacillus Bulgariscus membentuk karakteristik berupa batang, membentuk koloni dengan warna dasar biru keunguan dan susunannya tidak beraturan. Bakteri ini termasuk bakteri gram positif. Bakteri jenis ini tumbuh dilingkungan asam dan digunakan untuk membuat yoghurt.













BAB V
SIMPULAN DAN SARAN
5.1. Simpulan
Berdasarkan praktikum Mikrobiologi Umum dapat disimpulkan bahwa sesuatu yang hidup itu berasal dari sesuatu yang tak hidup. Hal tersebut dapat dibuktikan dengan kita melakukan berbagai kegiatan. Diantaranya sterilisasi, medium dan larutan pengencer, metode hitungan cawan, dan pewarnaan bakteri. Selama praktikum memerlukan bahan yang tak hidup misal larutan kefir, NA, alkohol, aquades, gram A, gram B, gram C, dan gram D. Bahan tersebut kita olah melalui proses-proses diatas dan ternyata menghasilkan suatu mikroba yang hidup didalam suatu bahan pangan. Jumlah bakteri dari sampel yang diperoleh jika dihitung menurut Standar Plate Count (SPC) dapat diketahui jumlah bakteri yang terhitung adalah 2,3 x 109 CFU/ml untuk sampel larutan PDA dan 1,7 x 108 CFU/ml bakteri pada sampel larutan NA. Dari hasil yang kita dapat medium NA sangat cocok digunakan untuk menumbuhkan bakteri dibandingkan dengan medium PDA.

5.2. Saran
Berdasarkan praktikum yang telah dilaksanakan, praktikum sudah bagus tetapi masih terdapat sedikit kekurangan pada fasilitas alat-alat dan bahan-bahan praktikum yang terdapat didalm laboratorium. Dengan demikian kami mengharapkan ada tambahan alat dan bahan untuk praktikum.
DAFTAR PUSTAKA

Cappucino, J.G dan Natalie S. 1983. Microbiology. Addison Wesley Publishing Company, Sydney.
Dwijoseputro, D. 2003. Dasar-dasar Mikrobiologi. Djambatan, Jakarta.
Fardiaz. 1994. Analisis Mikrobiologi Pangan. Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi Institut Pertanian Bogor, Bogor.

Gaman, P. M., dan Sherrington, K. B. 1992. Pengantar Ilmu Pangan, Nutrisi, dan Mikrobiologi. Universitas Gajah Mada Press, Yogyakarta
Lay, B. W. 1994. Analisis Mikrobia Di Laboratorium. Raja Grafindo Persada, Jakarta.
Megamii. 2009. Pemeriksaan Bakteri Secara Makroskopis. (http://Megamii.wordpress.com). Diakses tanggal 24 Mei 2009.
Michael, J. 1988. Dasar-dasar Mikroniologi. Universitas Indonesia Press, Jakarta.
Pelczar, M. J. 1988. Dasar-dasar Mikrobiologi. Universitas Indonesia Press, Jakarta.

Penn, C. 1991. Handling Laboratory Microorganism. Open University, Milton Keynes.

Pollack, D. S. 1992. Student Presentation. (http://web.uconn.edu). Diakses tanggal 24 Mei 2009.

Schlegel, H. G dan Schmidt, K. 1994. Mikrobiologi Umum. Gadjah Mada University Press, Yogyakarta.






LAMPIRAN
Lampiran 1. Menjawab pertanyaan
Sterilisasi
Pertanyaan :
1. Jelaskan perbedaan sterilisasi kering dan sterilisasi basah!
Jawab :
Sterilisasi kering dilakukan dengan pembakaran dan oven untuk mensterilkan peralatan logam dan kaca, sedangkan sterilisasi basah dilakukan dengan dengan autoklaf, uap bebas, atau air mendidih untuk mensterilkan peralatan, medium, dan bahan-bahan yang tahan uap.
2. Jelaskan tujuan sterilisasi!
Jawab :
Sterilisasi bertujuan untuk membebaskan alat-alat atau bahan-bahan dari segala bentuk kehidupan termasuk mikroba.

Medium dan Larutan Pengencer

Pertanyaan :
1. Jelaskan fungsi dari masing-masing komponen di bawah ini di dalam medium!
a. Pepton c. Ekstrak sapi
b. Agar d. NaCl
Jawab :
a. Sebagai protein sederhana untuk pertumbuhan mikroba
Lampiran 1. Menjawab pertanyaan (Lanjutan)
b. Sebagai media padat bernutrisi bagi mikroba
c. Sebagai proteinkompleks untuk pertumbuhan mikroba
d. Sebagai larutan buffer
2. Jelaskan perbedaan masing-masing medium di bawah ini!
a. Nutrient Agar
b. Potato Dextrose Agar
c. Lactose Broth
d. Plate Count Agar
e. Briliant Green Lactose Bile Broth
Jawab :
a. Nutrient Agar digunakan untuk pertumbuhan mayoritas dari mikroorganisme yang tidak selektif, dalam artian mikroorganisme heterotrof, misalnya bakteri.
b. PDA digunakan untuk menumbuhkan atau mengidentifikasi khamir dan kapang.
c. Lactose broth digunakan sebagai media untuk mendeteksi kehadiran koliform dalam air, makanan, dan produk susu, sebagai kaldu pemerkaya (pre-enrichment broth) untuk Salmonellae dan dalam mempelajari fermentasi laktosa oleh bakteri pada umumnya.
d. PCA digunakan sebagai medium untuk mikroba aerobik dengan inokulasi di atas permukaan.

Lampiran 1. Menjawab pertanyaan (Lanjutan)
e. Briliant Green Lactose Bile Broth sebagai media untuk isolasi, enumerasi, dan menumbuhkan sel khamir.
3. Sebut dan Jelaskan klasifikasi medium!
Jawab :
a. Medium berdasarkan sifat fisik
- Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelah dingin media menjadi padat..
- Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4% sehingga menjadi sedikit kenyal, tidak padat, tidak begitu cair.
- Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB (Nutrient Broth), LB (Lactose Broth).
b. Medium berdasarkan komposisi
- Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan takarannya secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar.
- Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui secara pasti, misanya PDA (Potato Dextrose Agar).
- Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang tidak dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahan dasarnya, misalnya Tomato Juice Agar, Brain Heart Infusion Agar, Pancreatic Extract.
c. Medium berdasarkan tujuan

Lampiran 1. Menjawab pertanyaan (Lanjutan)
- Media untuk isolasi yang mengandung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan mikroba, misalnya Nutrient Broth, Blood Agar.
- Media selektif/penghambat yang selain mengandung nutrisi juga ditambah suatu zat tertentu sehingga media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan merangsang pertumbuhan mikroba yang diinginkan
- Media diperkaya (enrichment) yaitu media yang mengandung komponen dasar untuk pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti darah, serum, kuning telur, misalnya Blood Tellurite Agar, Bile Agar, Serum Agar, dll.
- Media untuk peremajaan kultur
- Media umum atau spesifik yang digunakan untuk peremajaan kultur
- Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik.
- Media untuk karakterisasi ,contohnya adalah Nitrate Broth, Lactose Broth, Arginine Agar.
- Media diferensial untuk mengidentifikasi mikroba dari campurannya berdasar karakter spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial, misalnya TSIA (Triple Sugar Iron Agar).

Metode Hitungan Cawan
1. Bagaimana prosedur perhitungan total mikroba pada sampel susu bubuk hingga pengenceran 10-7 ? Hitung pula kebutuhan alat dan bahan !

Lampiran 1. Menjawab pertanyaan (Lanjutan)
- Alat: 8 tabung reaksi, 8 pipet hisap, 6 cawan petri, autoklaf, pengaduk magnetik
- Bahan: agar, vitacarm, aquades
- Prosedur:
Memasukkan 9 ml aquades ke dalam 8 tabung reaksi sebagai larutan pengencer lalu melakukan sterilisasi basah dalam autoklaf pada suhu 121 0C, tekanan 2 atm selama 15 menit. Menimbang 2.6 g agar lalu menambahkan 45 ml aquades, kemudian menghomogenisasi sampel tersebut dengan pengaduk magnetik. Menyiapkan dan memberi label larutan pengencer dan cawan petri steril, kemudian melakukan pengenceran sampai tingkat pengenceran 10-7. Sampel yang telah ditambahkan air merupakan tingkat pengenceran 10-1. Setelah itu mengambil 1 ml dari tiap tingkat pengenceran untuk pengenceran selanjutnya dan 1 ml untuk ditempatkan pada cawan pada 3 tabung terakhir. Satu pipet hisap hanya boleh digunakan untuk mengambil satu macam pengenceran.






Lampiran 1. Menjawab pertanyaan (Lanjutan)
2. Laporkan "Standard Plate Count" dari sampel di bawah ini!
Sampel Pengenceran SPC
10-2 10-3 10-4 10-5
Kaldu daging 280
262 45
28 3
1 -
- 3,2 x 104
Susu segar TBUD
TBUD TBUD
TBUD 708
782 158
302 7,4 x 106
Sosis TBUD 294 35 5 3,2 x 105
Dendeng 55 15 1 0 5,5 x 103

Pewarnaan Bakteri
Pertanyaan :
1. Sebutkan perbedaan bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif!
Jawab :
Dinding sel bakteri Gram positif memiliki kandungan peptidoglikan yang lebih tinggi dibandingkan bakteri Gram negatif dan dinding sel bakteri Gram negatif kaya akan lipid. Peptidoglikan dari dinding sel bakteri Gram positif mengikat warna ungu violet kristal, sedangkan lipid dari dinding sel bakteri Gram negatif telah larut oleh pencucian alkohol sehingga dipengaruhi oleh warna merah dari safranin.
2. Sebutkan jenis dan bentuk koloni bakteri yang termasuk patogen!
Jawab :
- Staphylococcus aureus, bentuk koloni seperti anggur


Lampiran 1. Menjawab pertanyaan (Lanjutan)
- Pseudomonas sp., bentuk koloni basil atau batang yang terpisah-pisah
- E.coli, bentuk koloni basil atau batang yang terpisah-pisah

Perhitungan Kadar Pembuatan Medium
1. Potato Dextrose Agar (PDA)
Kentang = 150 gr
Dextrose = 20gr
Agar = 20gr
APDA = 150 gr kentang dan aquadest 300 ml  140 ml APDA
Dextrose = = 2,8 gr
Agar = = 2,8 gr


2. Acidified Potato Dextrose Agar (APDA)
Kentang = 150 gr
Dextrose = 20gr
Agar = 20gr
Asam tartarat = 1%
APDA = 150 gr kentang dan aquadest 300 ml  140 ml APDA
Dextrose = = 2,8 gr

Agar = = 2,8 gr

Larutan asam tartarat 10%
= 1,4 ml


Lampiran 2. Perhitungan Standar Plate Count (SPC)
Perhitungan koloni yang diambil :
Jumlah koloni/ml = jumlah koloni x
Sampel Padat (NA) = 2,2 x 107
Sampel Padat (PDA) = 9 x 105